实验教学

 一、目的和要求

1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

2、掌握分光光度法——制作标准曲线、准确测定未知样品浓度。

3、进一步熟练掌握分光光度计的使用。

二、原理

蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操纵简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般的浓度测定较为适应。Folin-酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。本实验采用的是Folin-酚法。

Folin-酚法所用的试剂由两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸、色氨酸，故有此颜色反应, 蓝色的深浅与蛋白质的浓度成正比，可用分光光度法测定。

三、试剂和器材

1、试剂：

1.1 标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白配制成500μg/ml 蛋白溶液。

1.2 Folin-酚试剂：

试剂甲：临用前将4% 碳酸钠溶液与0.2mol/L 氢氧化钠溶液以等体积配合成碳酸钠-氢氧化钠溶液，将1% 硫酸铜溶液与2% 酒石酸钾钠溶液以等体积配合成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液，然后将这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin-酚试剂甲，此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：北京舟鼎国生物技术有限责任公司生产

2、器材：

试管及试管架、微量移液器、恒温水浴锅、优普纯水机、722型分光光度计

四、实验步骤

1、标准曲线的绘制：

取六支干净试管编号，按下表加入试剂：（单位毫升）

注意：蒸馏水和标液的添加顺序可以调换，Folin-酚甲试剂加入后摇匀室温放置10分钟，再加入Folin-酚乙试剂，摇匀室温放置30分钟后以1号管为空白进行比色，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。

2. 待测样品：人血清（稀释100倍）

准确吸取待测样液0.5ml于7号试管内，加入蒸馏水0.5ml、Folin-试剂甲5.0ml、Folin-试剂乙0.5ml，重复上步操作，测样品A500，对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。