实验教学

实验-DNA重组和基因工程

教学目的：掌握分子生物学操作最基本的技术---基因克隆的步骤、原理、操作的 注意事项。

本章重点：1）克隆工具，2）克隆技术及原理，3）克隆基本过程

本章难点：1）克隆载体与表达载体的结构与必要元件，及必要元件的作用，2）

限制性内切酶的原理及应用，3）PCR及测序的基本原理。

课程讲授：此章节分 4 部分讲述，课时 4 学时。

以将克隆载体上的 GFP（pUC119）亚克隆到表达载体 pMal-c2x上、诱导表达、蛋白表达结果检测为例讲述DNA 重组及基因工程所涉及的原理、技术、及方法。

1. 课程简介

1-1 实验目的：

分子生物学是当今生命科学研究的主流，其理论与技术已深入到生命科学的各个领域，特别是生物医学领域，与人类疾病的发生诊断和治疗各个环节密切相关。质粒 DNA 的分离纯化、质粒 DNA 的酶切图谱、琼脂糖凝胶电泳鉴定、感受态细胞的制备及DNA转化、DNA重组、外源基因的原核表达与检 测、PCR基因扩增等系统的常规分子生物学实验。

1-2 实验内容：

构建绿色荧光蛋白（GFP）的融合表达载体，放入大肠杆菌诱导表达，并检测GFP 表达的效果。实验涉及了基因工程中最基本的三个步骤：基因克隆、基因表达、及表达产物（重组蛋白）检测。

1-3 实验概述：

酶切目的 DNA 与表达载体；分离纯化后进行连接、转化、筛选；从阳性菌株中提取质粒 DNA（可能为重组 DNA），PCR 验证；重组 DNA 转化表达菌株后进行诱导表达及 SDS-PAGE 检测表达效果。

1-4 基因克隆技术

基因克隆：利用重组 DNA 技术，将外源 DNA 片段引入寄主细胞（如细菌），使其保存在寄主细胞中，并可以通过寄主细胞大量复制或表达的技术。技术路线如下：

2. 基因克隆常用工具

2-1 Enzymes 酶

1）限制性内切酶（Restriction endonuclease, RE）

（1）概述：RE 是从原核生物中发现，功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭，限制病毒的遗传物质在自己体内的存在的一种核酸内切酶。是原核生物限制病毒入侵的一种机制，与相应的甲基化酶 同时作用。

（2）RE 的命名规则

（3）二型限制性内切酶（Type II RE）

Type II 在基因克隆中最常用。TypeII RE 可以高度特异的识别双链 DNA 中特定碱基序列对其进行切割，并且切割位点也高度特异。它的识别位点一般为４～8bp 长的回文序列。识别位点在DNA分子中随机分布。我们可以根据自己的需要选择可以用的RE。

因为不同的切割方式，RE 所产生切口有３种不同类型：５’端突出 ，３’端突出，平末端。切口序列反向互补，被同种 RE 切断的分子可以通过 DNA 连接酶重新连接起来。

这是 DNA 重组的关键。

（4）同裂酶与同尾酶

– 同裂酶：来源不同、识别序列相同的 RE。同裂酶切割位点可以相同，也可以不同。

– 同尾酶：来源不同、识别序列不同、但产生的粘性末端相同的 RE。如XbaI与SpeI。

2）DNA连接酶DNA Ligase：连接DNA分子

DNA连接酶的功能是催化一条 DNA链 3’-OH和另一 DNA链的 5’-磷酸之间生成磷酸二酯键，从而把两段 DNA 链连接成一段完整的 DNA 链。两个 DNA 分子经 RE 酶切后形成的末端如果反向互补，可以通过 DNA 连 接酶连在一起形成一个分子。

3）碱性磷酸酶 Alkali phosphatase, ALK：

去除 DNA 分子 5’末端的磷酸基团，防止末端反向互补的线型 DNA 分子自连。基因克隆中，如要将外源基因连接连接到单酶切后的载体分子上，一般要用ALK处理酶切后的载体分子，尽量去除其 5’-P，减少连接反应中载体自连的现象。

2-2 载体 Vectors

1）载体的一般特点：

载体是用于携带外源 DNA 进入寄主细胞（host cell），并且使外源 DNA 能够在寄主细胞内复制（replication）与/或表达（expression） 的 DNA 分子，是外源DNA的运载工具。一般具备可以独立复制，易操作，易筛选等特点。

2）载体的分类 Classification of Vectors

（1）根据载体的来源，常用的载体可分为：

–Plasmid(质粒)；

–Viral vector (phage vector)；

–Cosmid：病毒与质粒的融合体（hybrids）；

–Artificial chromosome (人工染色体)：BAC, YAC。

其中质粒是基因工程中最常用的载体，而后面三种常用于基因组文库的构建。

（2）根据用途，载体可分为：

– Cloning vectors 克隆载体；

– Expression vectors 表达载体；

– Integration vectors 整合载体；

3）Cloning plasmid 克隆质粒：容纳外源DNA片段，并将其带入寄主细胞，使其在寄主细胞中大量复制，便于后续各种分子水平的操作与分析的质粒。

（1）特点：较小、易于各项分子操作；在受体细胞中拷贝数较高；易于导入受体细胞，在受体细胞中可以独立复制；易于从宿主细胞筛选，分离。

（2）必要组成元件：

– 复制启始子（ori) ；质粒的复制起始位点。

– 抗性基因（Antibiotic resistance）：选择标记，只有被转入该质粒的寄主细胞在添加了相应抗生素的培养基上才能生长。

– 多克隆位点 (MCS, Multiple cloning site or polylinker)：载体上的一小段含有多个RE识别位点、便于外源片段的插入的区域。

– 标记基因 (Marker gene or report gene)：如：LacZ’ gene，可以报告寄主细胞中携带的质粒插入了外源基因，不是必须的。

4）Expression plasmid 表达载体：

（1）组成：与克隆载体相比多了一个表达外源基因的表达框。

–复制启始子（ori, Origin of replication) ；

–抗性基因（Antibiotic resistance）；

–多克隆位点 (MCS, Multiple cloning site or polylinker) ：位于表达框中；

–标记基因 (Marker gene or report gene)；

–基因表达框（Gene expression cassette）；

表达框中各元件从 5’-3’依次为：启动子promoter；核糖体结合位点(RBS)；标签编码序列 Tag coding sequence (非必须)； MCS； terminator 终止子。

（2）分类：

– 单纯表达载体: 如上图质粒，如表达的外源蛋白无抗体，则纯化困难。

– 融合表达载体: 表达载体上带有标签（如：6×His, Myc, etc） 或蛋白（如 GST, MAL, GFP, etc）的编码序列。外源基因被克隆到他们的上游或下 游，并且两者在同一开放读码框，表达后形成融合蛋白。

2-3 寄主细胞 Host cells （E. Coli）

1）常用克隆菌株 Strains for cloning： recA1, endA1 突变体，克隆质粒在克隆菌株中比较稳定，并可以高拷贝的稳定遗传。质粒容易重克隆菌株中纯化出来。

– DH5a菌株： F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-, mk)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1。

– JM109菌株：recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Δ(lac-proA)/F’[traD36，proAB，lacIq，lacZΔM15]。

– TOP10菌株：F-，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)， φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr) endA1，nupG。

2）表达菌株 Strains for expression: 表达菌株染色体上带有可诱导表达的高效RNA 聚合酶基因。在选用表达菌株时，一定要注意外源基因启动子要和菌株中的 RNAP 要匹配。

3. 基因克隆常用技术

3-1 Agarose gel electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳

1）DNA 的电泳特性

– DNA 在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

– 在碱性环境下，相同碱基数量的双链 DNA（分子量大小相似）几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度从负极向正极方向移动。

– 不同长度的 DNA 片段：分子量不同，泳动速度不同，可进行分离。对于线性DNA 分子，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可以通过测定DNA分子的迁移速度来估算 DNA 片段的大小。

– 相同分子量、构型不同的DNA分子迁移速率不同。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

2）琼脂糖浓度选择：分离不同大小的DNA片段需要使用不同浓度的琼脂糖凝胶：分离分子量大的DNA片段使用低浓度胶，分离分子量小的DNA片段使用高浓度胶，一般使用：0.8%～1.0%的凝胶。

3）应用：

– 检测 DNA 片段的大小和多少

– 将混合液里、大小不同的DNA片段分离开：用来检测限制性内切酶反应后所得 DNA 片段的带型，判断重组载体是否构建成功、或分离 PCR 产物等。

– 琼脂糖凝胶中一般加入少量的溴化乙锭（EB）。EB接受紫外照射时能够被激发产生荧光，同时EB是一种核酸嵌入剂，可以插入DNA的碱基平面中结合到 DNA分子上，因此 EB可以在紫外灯下指示 DNA在凝胶中的位置。

3-2 限制性内切酶分析

1）限制性内切酶图谱

在DNA分子示意图上按比例标记出其中的 RE酶切位点或/和各位点间的距离后所绘成的图就是限制性内切酶图谱。不同的DNA分子序列不同，限制性内切酶图谱不同。可以利用特异性的酶切片段鉴定DNA分子的正确性。

2）限制性内切酶分析重组的正确性

– DNA 分子经过一种或几种限制性内切酶酶解后可以产生的特定大小的片段。

– 重组分子，由于新 DNA 的插入会导致酶切后片段的大小发生改变。改变包括新片段本身的长度，和新片段中可能引入的新酶切位点。

3-3 PCR 基因扩增技术：利用特异性引物扩增特异地扩增目的DNA片段

1）概念：聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。以目的DNA片段为模板，与其两侧互补的一对寡核苷酸分子为引物，在耐热性DNA聚合酶的作用下，经变性、退火和延伸 n 个循环后，使目的DNA片段扩增2n倍的技术。

2）反应体系：

dNTP（DNA合成的原料），缓冲液buffer（提供反应所需的生理环境），模板 template（含目的基因的DNA分子），引物primers (一对，与待扩增片段两头的序列特异性结合)，耐热DNA聚合酶（Taq 等，合成 DNA）

3）程序及原理：

– 变性 denaturing：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA，称之为变性。通常设置为94℃ for 15”。

– 退火 annealing：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段 DNA 片段。 引物 Tm-5℃ for 15”。

– 延伸 extension：从结合在特定 DNA 模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。72℃条件下扩增效率为1kb/min左右。

– ～32 循环，三个循环后出现所需的目的片段。

4. 实验设计

4-1 实验目的：

将 pUC119-GFP上的GFP基因亚克隆到pMAL-c2x表达载体上，在大肠杆菌中进行蛋白表达。

4-2 具体实验步骤

1）目的片段及载体的制备

（1）限制性内切酶 EcoRI 与 HindIII 酶解受体及供体质粒，分离目的基因（GFP），切割供体质粒，为构建重组质粒提供材料。限制性内切酶酶解反应。

注意事项：缓冲液提供RE工作所需的离子浓度及 pH 值，不同RE所用的缓冲液不一定相同。双酶切时需注意，如二酶无法在同一缓冲液中进行反应，则可以选择先做一种酶的酶解反应，酶解产物经纯化处理后，再进行第二种酶的酶解反应。酶的总用量不能 超过反应总体积的10%。因为酶中含有50%的甘油，而反应中，甘油比例超过 5%会抑制反应。另外，不是所有的 RE的反应温度都为 37℃，要 注意选择适合的酶解温度。

（2）琼脂糖凝胶电泳分离酶解混合液，并从胶上切割出目的片段，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒，按盒中所带 protocol进行操作。最后DNA片段洗脱在 25 μL 的灭菌蒸馏水中。取少量回收产物进行电泳，与知道浓度的Marker相比较估算所得 DNA的浓度。一定范围内，条带的亮度与DNA的质量成正比。

2）载体与目的片段连接：

用 T4  DNA 连接酶连接载体片段和外源片段，连接反应中外源片段与载体片段的摩尔数比≈3:1~10:1。连接在 4 度进行 24 小时。

3）获取重组质粒：连接反应最后形成的是一个混合物，其中包括连接好的重组质粒，与未连接的片段。我们需要将此混合液转化的细菌中，由细菌帮 我们筛选。

（1）转化（Transformation）：将质粒导入寄主细胞（大肠杆菌）的过程。大肠杆菌的克隆或表达菌株通过 Ca²⁺，低温处理后，在热激条件下可以接受外源DNA（质粒），这种细菌被称为感受态细胞。将连接混合液与感受态细胞混合，42度热激，外源 DNA 即可进入感受态细胞。

（2）筛选：将转化过的大肠杆菌涂布在有有抗生素的平板上生长。所用抗生素与导入质粒的抗性基因相匹配。只有含有外源质粒的细胞才能生长繁殖，形成菌落。

4）重组质粒的鉴定：鉴定抗生素平板上长出的阳性克隆是否含有重组外源质粒。

（1）从阳性克隆中提取质粒。常规质粒提取方法是碱裂解法。用碱溶液对细菌进行适当裂解，释放出 质粒，在利用层析柱纯化质粒DNA。裂解细菌释放DNA需要三种溶液：

–溶液Ι，细胞悬浮液(Resuspend solution)：

50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）

–溶液Ⅱ，细胞裂解液(Cell lysis solution)：

0.2 mol/L NaOH，1%SDS；裂解细胞，还会使得 DNA 变性

–溶液Ⅲ ，中和溶液（Neutralization solution）：

60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸，28.5 ml 蒸馏水 (pH 5)。使得质粒复性，但染色体 DNA 不容易复性。并且 K⁺置换 SDS 中的 Na⁺，生成十二烷基硫酸钾，超不溶于水。它析出时，将其连着的蛋白，脂类，染色体DNA等附带也从溶液中沉淀出来。

溶液 III 处理完后，离心取上清液再通过层析柱纯化出里面的DNA。

（2）PCR 鉴定重组质粒的正确性

利用一对GFP特异性引物，以所提取的质粒为模板进行PCR反应，重组质粒中应该含有GFP序列，可以被特异性引物扩增出目的条带，如果是非重组质粒，其内没有GFP序列，就不能被扩增出任何产物。

5）外源蛋白表达

将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株中，加IPTG诱导蛋白的表达。收集表达后的细菌，提取蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。与为诱导的细菌蛋白样品比较，检测外源蛋白是否得到表达。

复习题：

1. 克隆的基本步骤。

2. 表达载体与克隆载体的基本元件（必要元件）及各元件的作用。3. 蓝白斑筛选的原理。

4. 实验室新提取的一个质粒 DNA，在 0.8%琼脂糖凝胶上电泳时，泳动速度与～4kb 左右的线型DNA相似；用 EcoRI 酶切后，产生一条3kb的带； HindIII+EcoRI双酶切形成1、2、3kb三条带，请绘制其一种可能的限制性内切酶图谱。

5. PCR 的原理及 Sanger 测序法。

6. 质粒 DNA 提取时碱裂解法三种工作溶液的作用原理。

7. 下图为一个 dsDNA 分子的一条链（只显示了分子两头的序列），如果想通过PCR扩增此片段，请设计一对引物。条件：1. 每条引物 18 nt；2. 从 5’到 3’ 的顺序写出每个引物的序列。

CAAGTGTCACACACC………………TAACAACTGCTGC