实验教学

 一．实验目的

分子生物学是当今生命科学研究的主流，其理论与技术已深入到生命科学的各个领域，特别是生物医学领域，与人类疾病的发生诊断和治疗各个环节密切相关。本课程拟在理论课程教学的基础上，面向生物学各专业本科生开设包括质粒DNA的分离纯化、质粒DNA的酶切图谱、琼脂糖凝胶电泳鉴定、感受态细胞的制备及DNA转化、DNA重组、外源基因的原核表达与检测、PCR基因扩增、逆转录PCR基因扩增、蛋白质转移等系统的常规分子生物学实验。加深学生对专业知识的理解，拓宽专业知识面，比较全面系统地掌握分子生物学的常规操作。突出自我统筹安排实验能力的培养，强化动手能力、观察能力和分析/解决问题的能力，掌握有关实验仪器的使用方法，更好地适应高速发展的生物技术，并与研究生教育接轨。

二．实验内容

实验一 移液器的使用                             （2学时）

1、实验目的

在进行分析测试方面的研究时，一般采用移液器（micropipette）量取少量或微量的液体。本次课程学习移液器的正确使用方法及其一些细节操作，以便于后期实验严谨的定量操作。

微量的单位定义为微升（microliter，µL）

1升(liter，L) 等于 1,000 毫升(milliliters，mL)，

1毫升等于 1,000 微升（microliter，µL）

2、实验要求

（1）、移液器量程认读

不同型号的微量移液器，各有其吸取体积范围，依取用溶液体积选用适当的微量移液器。

（2）、数值窗口的认读

3、移液器的使用

（1）、设定移液体积

根据吸取液体的体积，选择适当的移液器。

在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。

（2）、枪头的装配

将移液器垂直插入微量移液器枪头 (tip)中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合，上紧即可。

P1000 使用蓝色微量移液器头，P200 及P20 使用黄色微量移液器头，P2 使用白色微量移液器头。

严禁移液器撞击枪头，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，长期这样操作会导致移液器的零件损坏。

（3）、移液的方法

吸取液体时，移液器保持竖直状态（角度控制在倾斜20度之内），将枪头插入液面下。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。

这时可以采取两种移液方法。

一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。

二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有残留液体的枪头，弃之。

吸液速度：移液操作应保持平顺、合适的吸液速度；过快的吸液速度容易造成样品进入套柄，带来活塞和密封圈的损伤以及样品的交叉污染。

（4）、枪头浸入深度建议如下所示：

移液器规格	吸头浸入深度
2µL和10 µL	1 mm
20µL和100 µL	2-3 mm
200µL和1000 µL	3-6 mm

（5）、移液器的正确放置

使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。

4、移液器使用注意事项

（1）、如不使用，把移液器量程调至最大值，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。

（2）、套有微量移液器头的微量移液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。

（3）、吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干净，擦干后再正确组合回复原状。

（4）、若不小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱等各部位以清水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状。

（5）、定期自行以天平检查准确度，若有任何问题请送厂维修。

实验二  质粒（表达）DNA 的酶切                  （4学时）

1、实验目的

通过DNA 限制性内切酶实验掌握酶学操作技术。

2、实验原理

不同酶切反应都需要不同的酶切缓冲液，多数生物技术公司的产品目录中均有关于何种限制性内切酶适合何种缓冲液的资料可供查阅。绝大多数酶的反应温度是在37℃。酶切反应时间有30 分钟、60 分钟，以至2 小时以上甚至过夜。本次实验要进行的是对重组质粒进行限制性酶切；琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，可用于分离、鉴定和纯化DNA片段（如DNA 片段分子量的大小、纯度等）。利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA 的移动度，可测定DNA 片段的相对分子量。一般800bp 以上的片段用0.8%的琼脂糖凝胶，800bp 以下的片段，用1.0%-2.0%的琼脂糖凝胶。用溴化乙锭或其他无毒荧光染料染色，在紫外灯下可以直接确定并分析DNA 片段在凝胶板中的迁移率。

3、基本要求

通过学习限制性内切酶操作、反应体系、反应条件，进一步了解限制性内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA 的酶切技术。

4、重点/难点

了解限制性内切酶特性，掌握DNA酶切技术。

5、实验内容与步骤

Ø 在离心管管中以编号次序加入以下相应试剂：

（1）ddH20 7μl

（2）10×Buffer 2μl

（3）质粒DNA 10μl

（4）内切酶 1μl

（5）

总体积 20μl

Ø 37℃水浴酶切。

Ø 制备0.8%琼脂糖凝胶：将配好的电泳缓冲液，倒入电泳槽；将琼脂糖凝胶放入微波炉熔化；熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中；静置1 小时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂直拔去梳子；将琼脂糖凝胶放入电泳槽中。

Ø 37℃水浴1.5 小时后，终止酶切反应。

Ø 取单酶切反应液10μl 和上样缓冲液2μl，混匀，标准分子量DNA（DNA Marker） 5μl，待作电泳上样液。（点样,一般上样量为10×Loading Buffer 0.5-1μl、DNA 样品（质粒）3μl 混匀，点入凝胶孔内；质粒电泳参数：电泳仪的电压100V，电流500mA，功率250W。电泳时间40 分钟。）

Ø 0.8%的琼脂糖凝胶电泳。

Ø 将琼脂糖凝胶取出，放入紫外与可见分析装置或凝胶成像系统显像，拍照。紫外灯下观察酶切琼脂糖凝胶电泳图。

 

实验三  核酸的琼脂糖凝胶电泳                  （4学时）

1、实验目的

学习掌核酸的琼脂糖凝胶电泳技术。

2、实验原理

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

3、基本要求

通过学习电泳的基本原理、基本操作以及常用电泳介质的特性，掌握琼脂糖凝胶的制备、电泳以及核酸显色与观察技术。

4、重点/难点

不同介质的分辨率以及电泳体系对电泳结果的影响。

5、实验内容与步骤

（1）、用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

（2）、调整好梳子的高度；

（3）、称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中；

（4）、凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；

（5）、将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；

pUC18 5µl + ddH2O 3µl + 溴酚蓝2µl 共10µl于0.5ml tube中混合后点样；

（6）、将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

（7）、电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

 

 

实验四与五  胶回收法纯化DNA 及DNA体外重组    （8 学时）

1、实验目的

本实验利用胶回收纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中将目的DNA 片段进行抽提纯化，掌握切胶技术、回收目的DNA 片段与纯化的方法以及载体片段与外源片段体外连接的方法（包括DNA连接酶的酶学操作和作用特点）。

2、实验原理

琼脂糖凝胶电泳作为分子克隆的核心技术，经常用于分离、纯化DNA。胶回  收是指目的DNA 片段经由琼脂糖凝胶电泳与其它片段分离，再从琼脂糖凝胶中将目的DNA 片段抽提纯化出来的过程。

3、实验内容与步骤

Ø  目的DNA 电泳。

Ø  切出含有目的DNA 的凝胶。

Ø  称量胶块重量，计算胶块体积。

Ø  向胶块中加入胶块融化液。

Ø  75℃加热融化胶块。

Ø  将溶液转移至Spin Column 中离心1 分钟，弃滤液。

Ø  用Rinse A，Rinse B 冲洗SpinColumn。

Ø  在Spin Column 膜的中央处加入25 μl 的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，   12,000 rpm 离心1 分钟洗脱DNA。

Ø  取胶回收目的基因片段洗脱液1μl 加上10×Loading Buffer 1μl 及荧光染料混匀。

Ø 紫外观察检测。

Ø T4 DNA 连接酶连接载体片段和外源片段。16度16小时，4度保存备转化用。

实验六与七  氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 （6学时）

1、实验目的

掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和重组DNA 质粒（或连接产物）转化至大肠杆菌宿主的操作技术。

2、实验原理

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

3、基本要求

了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过

程，掌握重组DNA 质粒转化大肠杆菌的操作技术。

4、重点/难点

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术。

5、实验内容与步骤

感受态细胞的制备：

1) 挑菌37℃培养。

2) 将过夜培养的细菌转接培养2-3 小时。

3) 将菌液置冰上10 分钟，4℃离心8000rpm 30 秒。

4) 用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。

5) 氯化钙溶液悬浮菌体。

转化：

1) 取出感受态细胞,试剂A，无菌双蒸水和待转化的质粒DNA，均置冰盒内。

2) 取离心管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20分钟。

3) 在管内加入400ul LB 液体培养基，振荡培养10-40 分钟。

4) 涂布培养。

实验八  质粒DNA（连接重组） 的提取             （4学时）

1、实验目的

本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET-22b 的抽提，掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的基本原理。

2、实验原理

载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内进行克隆与表达。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13 噬菌体、逆转录病毒DNA 和昆虫病毒DNA 等，而质粒是最常用的载体。

3、实验内容与步骤

Ø 收集菌泥。

Ø 悬浮细菌。

Ø 加入200μl 裂解液 (Solution 2)，充分裂解菌体。

Ø 加入400μl 絮凝剂(Solution 3)。

Ø 15000rpm 离心10 分钟，无需低温离心。

Ø 将步骤5 中的上清转移到吸附柱(3S) 中，12000rpm 离心1 分钟。

Ø 将吸附柱放入同一支收集管中，吸取洗涤液到吸附柱，离心1 分钟。

Ø 重复步骤7 一次。

Ø 将吸附柱放入同一支收集管中，高速离心2 分钟。

Ø 在吸附柱(3S)膜中央加50μl 无菌双蒸水，室温高速离心1 分钟。

质粒电泳图

用于小量制备制备质粒DNA的碱裂解缓冲液

溶液I

50 mmol/L   葡萄糖

25 mmol/L   Tris·Cl（pH8.0）

10mmol/L   EDTA（pH8.0）

溶液I可一次配制100mL，在10 lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸汽灭菌15min。保存于4℃.

溶液II

0.2mol/L   NaOH （从0.4 mol/L贮存液中现用现稀释）

1% SDS （从2% 贮存液中现用现稀释）

溶液III

5 mol/L乙酸钾         60mL

冰乙酸                11.5mL

水                    28.5mL

实验九  重组DNA 的PCR 扩增（检测）          （4学时）

1、实验目的

学习PCR 反应的基本原理与实验技术。

2、实验原理

多聚酶链式反应的原理类似于DNA 的天然复制过程。在反应体系中加入待扩增的DNA 片段和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物、DNA聚合酶、缓冲液、聚合反应底物（dNTP）以及必需的金属离子（酶激活剂），经变性、退火和延伸后，DNA 分子摩尔数可呈理论指数增加。

3、基本要求

熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解 PCR 反应条件的优化和注意事项和应用范围 掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。

4、重点/难点

聚合酶链反应（PCR）的实验技术及注意事项。

5、实验步骤

Ø 在0.2ml 离心管管内配制50μL 反应体系：

（1）ddH2O 38μL

（2）10×buffer 5μL

（3）dNTP 1μL

（4）Taq 酶 1μL

（5）引物1 1μL

（6）引物2 1μL

（7）模板DNA 3μL

Ø 按下列程序进行扩增：

（1） 94℃预变性5 分钟；（2） 94℃变性50 秒；

（3） 55℃退火50 秒； （4） 72℃延伸10 秒；

（5）重复步骤②-④30 次；

（6） 72℃彻底延伸10 分钟。

琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果。

实验十  外源基因的原核（大肠杆菌）表达         （4学时）

1、实验目的

学习外源基因在宿主细胞中的诱导表达及利用聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分析检测目的蛋白表达效果的基本原理与方法。

2、实验原理

最广泛使用的不连续缓冲系统是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的，样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3)，分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS (Laemmli，1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。 

3、基本要求

学习并掌握外源基因在宿主细胞中的诱导表达和利用聚丙烯酰氨凝胶电泳分析蛋白质表达效果、测定蛋白质分子量的基本原理、操作技术和方法。

4、重点/难点

掌握聚丙烯酰氨凝胶的配制方法，了解聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白质的基本步骤及实验结果的判定。

5、实验内容与步骤

Ø 带有外源基因的表达菌过夜培养。

Ø 过夜培养物20%接种量转借培养至OD600为0.60以上，加入100微克/mL的IPTG于室温诱导表达2-3小时。

Ø SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制

①  以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

②  用去离子水配成10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）贮存液保存于室温。

③  用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。

④  TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。（购买液体）

⑤  配制10%的过硫酸铵。

⑥  配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

Ø SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

⑴ 根据厂家说明书安装玻璃板。

⑵ 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液

⑶ 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液并使分离胶液面平整。

⑷ 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

⑸ 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸

⑹ 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

⑺ 在等待浓缩胶聚合时，收集1毫升诱导培养液中的菌体，按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。

⑻ 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

Tris-甘氨酸电极缓冲液：

25mM Tris

250mM 甘氨酸 (pH 8.3)

0.1% SDS

⑼ 按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。

⑽ 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。

⑾ 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

Ø 用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。

染色液：

0.1% 考马斯亮蓝 R250

40% 甲醇

10% 冰醋酸

染色1～2小时或过夜。

脱色液：

10% 甲醇

10% 冰醋酸

脱色需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。

此方法检测灵敏度为0.2～1.0 mg。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照。

三．实验学时安排（总课时为36学时）：

序 号	实    验    名    称	周次	学时	类型
实验一	移液器的使用		2	基础
实验二	质粒（表达载体）DNA 的酶切		4	综合
实验三	琼脂糖凝胶电泳实验		4	基础
实验四	胶回收法纯化DNA		4	基础
实验五	DNA体外重组		4	综 合
实验六	大肠杆菌感受态细胞的制备		3	综 合
实验七	大肠杆菌感受态细胞的转化		3	综 合
实验八	质粒DNA（连接重组） 的提取		4	综 合
实验九	重组DNA 的PCR 扩增（检测）		4	验 证
实验十	外源基因的原核（大肠杆菌）表达		4	综 合

四、考试方式

每次实验上交实验报告，学期末汇总平均分数。

五、教材与参考书目

《精编分子生物学实验指导》 刘维全、高士争、王吉贵 主编. 化学工业出版社，2009/4。

《生物化学与分子生物学实验指导》 -(第2版)，李林.  人民卫生出版社，2008/6

《分子克隆实验指南》，萨姆布鲁克等。科学出版社，1999.

执笔人：李红民

审定人：