实验课程

考试方式：实验报告+出勤率

参考书目：细胞生物学实验（第二版）杨汉民主编 高等教育出版社

细胞生物学实验（第二版）李芬 胡海燕 科学出版社

实验一 细胞的凝集反应

一、 实验目的

学习研究细胞凝集反应的方法，了解细胞发生凝集反应的原因。

二、实验原理

凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。凝集素使细胞凝集是因为它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。大多数凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。凝集素与糖结合的活性及专一性决定其功能。

三、实验材料

实验材料：马铃薯块茎试剂：

(1)磷酸缓冲液：分别称取NaCl 7.2g、Na2HP04 1.48g、KH2P04 0.43g用蒸馏水溶解，混合后用蒸馏水定容至1000ml，用（NaOH）调pH值至7.2。

(2)生理盐水：0.9％氯化钠无菌水溶液

(3)硫酸铵

仪器与器材：离心机，光学显微镜，研钵（2），药匙（2），离心管（7ml，2个），带刻度（2ml）滴管，25ml烧杯，玻璃棒，10ml量桶，载玻片，盖玻片，滤纸，吸水纸。

四、实验步骤：

1. 2%鸡血细胞制备：以抽取鸡的静脉血液（含0.2％肝素钠）用生理盐水洗3次，每次1500r/min离心5min，最后按沉淀压积的红细胞体积加生理盐水配成2%鸡血细胞液。

2.马铃薯块茎：

(1)提取凝集素：称取马铃薯去皮块茎4g，切成小块，加5ml磷酸缓冲液，浸泡1.5 h，浸出的粗提液中含有可溶性马铃薯凝集素。

(2)测定血凝活性：用滴管吸取马铃薯凝集素粗提液和2%鸡血细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置10 min后于显微镜下观察细胞凝集现象。用一滴磷酸缓冲液和一滴2%鸡血细胞液混合作为对照观察。

五、结果与分析

绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。

六、思考题

1.植物细胞凝集素在鸡红细胞凝集过程中起什么作用？

2.哪些因素影响细胞凝集反应？

实验二 细胞膜的通透性观察

一、实验目的

1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。

2.了解溶血现象及其发生机制。

二、实验原理

细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

三、实验用品

(一) 材料

鸡血红细胞

（二）器材

普通显微镜、普通离心机、10ml 试管、10ml 刻度离心管、试管架、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。

（三）试剂

1.  0.17 mol/L 氯化钠。

2.  0.17 mol/L 氯化铵。

3.  0.17 mol/L 醋酸铵。

4.  0.17 mol/L 硝酸钠。

5． 0.12 mol/L草酸铵。

6.  0.12 mol/L硫酸钠。

7.  0.12 mol/L 葡萄糖。

8.  0.32 mol/L 甘油。

9.  0.32 mol/L 乙醇。

10. 0.32 mol/L 丙酮。

四、实验操作

1．2%鸡血细胞制备：以抽取鸡的静脉血液（含0.2％肝素钠）用生理盐水洗3次，每次1500r/min离心5min，最后按沉淀压积的红细胞体积加生理盐水配成2%鸡血细胞液。

2. 取10支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。

五、结果分析

1. 试管内液体为红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。

2. 如果试管内液体混浊，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。

3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。

注意：试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。

六、实验报告

表4-1 各种溶液的溶血现象观察结果

编号	测试溶液	是否溶血	时间	结果分析
1	0.17 mol/L 氯化钠
2	0.17 mol/L 氯化铵
3	0.17 mol/L 醋酸铵
4	0.17 mol/L 硝酸钠
5	0.12 mol/L草酸铵
6	0.12 mol/L硫酸钠
7	0.12 mol/L 葡萄糖
8	0.32 mol/L 甘油
9	0.32 mol/L 乙醇
10	0.32 mol/L 丙酮

书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表。

目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－

实验三  DNA的细胞化学——Feulgen反应

一、实验目的

了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。

二、实验原理

DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、实验仪器、材料和试剂

（一） 仪器、用具

显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。

（二） 材料

洋葱鳞茎，小麦根尖

（三）试剂

1.1N 盐酸的配制

取82.5ml比重1.19的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。

2.Schiff试剂的配制及保存

称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。

3.亚硫酸水

取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml 1N HCl，三者于使用前混匀。

四、方法与步骤

1.将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中，加热到60℃水解8～10 min。

2.蒸馏水水洗。

3.Schiff试剂遮光染色30min。

4.用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。

5.水洗5min。

6.将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。

7.显微镜检查。

结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。

五、作业

1.简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。

2.绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。

实验四 线粒体和液泡系的超活染色

一、实验目的

1.观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；

2.学习一些细胞器的超活染色技术。

二、实验原理

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法.其目的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡.活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态.

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同, 活体染色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的. 体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其“电化学”特性与被染部分相互吸引被选择固定在活细胞的某种结构中而显色．

但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用.詹纳斯绿Ｂ和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性．詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基. 中性红对液泡系的染色具有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核和细胞质不着色,这可能与液泡中的某些蛋白质有关.

三、实验用品

１. 器材：

显微镜、恒温水浴锅、、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸

２.试剂：

①Ringer溶液

氯化钠：0.85g；氯化钾：0.25g;氯化钙；0.03g

②1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液

称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5ml Ringer溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液.

取1ml1%原液加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力.

③1/3000中性红溶液

称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存.

临用前取1ml1%原液加入29mlRinger溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用.

3.材料：

洋葱鳞茎内表皮细胞

小麦幼根根尖

四 实验方法

（一）线粒体的超活染色与观察

２. 洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察

用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮放置在载玻片上，1/5000詹纳斯绿B溶液滴加1滴，染色10－15min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片，显微镜下观察．　

（二）小麦幼根根尖液泡系的中性红染色观察

用切取初生小麦幼苗根尖（1－2cm）纵切面切片放置在载玻片上，滴加1滴1/3000中性红溶液。

染色5－10 min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察。

五、结果与分析

1.洋葱鳞茎内表皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析；

2.绘出小麦幼根根尖细胞示液泡系的形态与分布并简要分析．

  实验五 细胞骨架系统的显示与观察

一、实验目的

1、掌握考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250）染细胞胞质微丝的方法。
2、 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。

二、实验原理

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。
染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。

三、实验用品

材料：

洋葱鳞茎内表皮细胞或培养的成纤维细胞。
试剂：

0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法、 M-缓冲液 、1%的Triton X-l00/M-缓冲液、0.2%考马斯亮蓝R250染液、 30%戊二醛-PB溶液，pH7.2  

器材：

普通光学显微镜、恒温箱、培养皿、烧杯、吸管、载玻片及盖玻片、镊子。

四、实验操作

撕取一薄片洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm3）于载玻片上
                       ↓
                PBS液轻轻涮洗
                      ↓
         l% TritonX-l00/M-缓冲液处理l5min（室温或37℃）
   （Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架图像更清晰）
                       ↓
          M-缓冲液轻轻洗细胞3次（稳定细胞骨架）
                   ↓
         3%戊二醛-PB液固定细胞5~l5min
                   ↓
              PBS液洗细胞若干次
                   ↓滤纸吸干
            0.2%考马斯亮蓝R250染片30min
                  ↓
            小心地用水漂洗
                  ↓
               空气干燥
                  ↓
               直接观察

五、结果与分析

描绘所观察到的细胞张力纤维图像

实验六 植物染色体标本的制备与观察

一、实验目的

1、掌握常规压片法制备植物染色体标本。

2、了解中期染色体的形态和结构以及染色体的生物学意义。

二、实验原理

染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定形式，是染色质紧密包装的结果，对染色体的观察在研究生物进化、发育、遗传和异变中有十分重要的作用。

植物染色体标本的制备，常用分生组织如根尖、茎尖和嫩叶做材料。常规压片法仍是当今观察植物染色体常见的方法，其程序包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片等步骤，简单易操作，但是染色体易变形、难分散开。

三、实验仪器、材料和试剂

（一）仪器、用具：显微镜、剪刀、镊子、刀片、培养皿、滤纸、吸水纸、青霉素瓶、染色缸、载玻片、盖玻片、玻璃板、酒精灯。

（二）材料：蚕豆(Vicia faba, 2n=2x=12)根尖。

（三）试剂

1、 Carnoy固定液、1%秋水仙素(或对二氯苯)。

2、苯酚品红染色液。

四、实验方法与步骤

压片法制备染色体标本：

(1) 取材：把蚕豆种子预先浸泡12h，然后转入垫有湿润滤纸的培养皿中上面蒙上湿纱布，置25℃温箱中暗培养发根，经过48h后幼根长至1—2cm左右，于上午9—11时剪下根尖。

(2) 预处理：将剪下的根尖置于对二氯苯饱和水溶液或0.1％秋水仙素溶液中，浸泡处理2-4 h。

(3) 固定：用水洗净处理过的根尖，经Carnoy固定液中固定2-4h，转入70％乙醇中，4℃保存备用。

(4) 解离：取出根尖，用蒸馏水洗净，放入l M HCl中60℃解离8－10min，再用蒸馏水洗净。

(5) 染色：改良苯酚品红染色5—10min。

(6) 压片：把根尖放在载玻片上、切取分生区部分、加一滴45 %醋酸，盖上盖玻片，用力垂直猛压，盖玻片上放上一滤纸，用铅笔上的橡皮头轻轻敲打盖片，使细胞和染色体分散。

（7）镜检

五、结果与分析

验交各个时期的图片一张，要求细胞分析均匀，形态完整。

实验七．植物愈伤组织的诱导和分化

（培养基的制备以及无菌操作）

一、实验目的

了解培养基的配制过程；掌握植物外植体的选择和表面消毒方法；掌握无菌条件下愈伤组织的诱导操作方法；了解植物组织脱分化过程中的形态变化特点。

二、实验原理

根据植物细胞的全能性，利用植物激素中的生长素和细胞分裂素等两类重要激素的不同配比，人为控制细胞的分裂和分化方向，实现对植物细胞和组织的脱分化、再分化和生根等。本实验以烟草叶片为外植体，进行愈伤组织的诱导，即叶片组织的脱分化实验，以便掌握基本的植物组织培养实验操作方法。

另外，自1973年基因工程诞生以来，烟草易于进行组织培养、容易得到转化植株而成为典型的基因工程模式植物，加之由于其蛋白含量高，被普遍认为是理想的生物反应器受体植物。通过组织培养烟草将具有重要意义。

三、实验材料,仪器和试剂

⑴　实验材料

无菌生长的烟草苗。

⑵ 实验器具

高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、酒精灯、镊子、脱脂棉、打火机、量筒、移液管、锥形瓶（灭菌）、培养皿（灭菌）、无菌滤纸、封口膜、灭菌绳。

⑶ 实验药品和试剂

70%酒精、20% NaClO、无菌水，培养基配制用药品见附件。

四、实验步骤

⑴ MS培养基的配置

烟草愈伤组织诱导培养基: MS + 6-BA 2 mg/L + NAA 2 mg/L + 蔗糖 30g/L + 琼脂 8 mg/L。

烟草愈伤组织诱导所用的培养基为MS基本培养基。各种MS母液和激素母液均按附件中的配方配制。

烟草愈伤组织诱导培养基按下表配制:

试剂	用量（1000 ml）
MS无机大量元素（20×）	50 ml
MS无机微量元素（1000×）	1 ml
MS铜钴母液（2000×）	0.5 ml
MS 有机（200×）	5 ml
铁盐（200×）	5 ml
蔗糖	30 g
水解酪蛋白	1 g
6-BA（0.2 mg/ml）	10 ml
NAA (0.2 mg/ml)	10 ml
定容至1 L，调pH为5.8，后在加入
琼脂	8 g

高压蒸汽灭菌20分钟。同时应该对锥形瓶、培养皿和滤纸进行灭菌。

灭菌完后，待培养基冷却至60-70 ℃左右，在超净工作台上将培养基分装至灭菌锥形瓶中，每瓶约40 ml。然后置于平整的台面上让培养基凝固备用。

⑵ 无菌操作

选取幼嫩的烟草叶片，用医用手术刀将叶片切成1 -2 cm2左右的小块，接种于诱导培养基中。。

⑶ 愈伤组织的诱导

将接种有烟草叶片的诱导培养基放至光照培养箱中培养。培养条件为26 ℃，12小时光照/12小时黑暗。大约2-3天后可以见到烟草叶片增厚卷曲。5-6天后可以见到叶片边缘膨大开始出现愈伤组织。大约10天后愈伤组织比较明显。3周后可以得到很好的胚性愈伤组织，也可以挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养或其他后续操作，如原生质体的培养和转基因等。

⑷ 实验数据的记录和分析

仔细观察植物细胞和组织脱分化的过程，并拍照保存图片。统计叶片愈伤组织的诱导率。

五、结果与分析

⑴ 详细描述植物细胞和组织脱分化的过程，并附上图片。

⑵ 简述植物组织培养的关键步骤。