（按照课程章节结构，详细阐述各章节主要内容以及教学重点和难点，充分反映课程的知识和技能要求，体现课程特点；对于实践教学环节如实验、实习、上机、研讨等，应具体说明实践的基本教学内容、教学要求等。） 细胞工程 实验一 烟草不定芽的诱导 实验目的 培养材料的灭菌与接种是细胞工程无菌操作技术中一个重要的环节。通过本实验，领会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作技术，掌握利用叶片作为外植体进行无性繁殖的方法。 实验器材 超净工作台、镊子、酒精灯、烧杯、1.5ml离心管、1ml移液器、滤纸、剪刀、玻璃培养皿、三角瓶、烧杯。 实验药品 MS培养基各种母液、6-BA、NAA、蔗糖、琼脂、酒精、无菌水、烟草叶片。 实验步骤 1、培养基的配制 ①芽诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg/L(单位下同)。 ②生根培养基：MS + NAA 0.2。 上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8。 2. 烟草叶的无菌处理 （1）准备好培养基MS0，无菌水，1ml移液器及接种工具。 （2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。 （3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。 （4）将烟草叶放于500ml的烧杯中，用250ml 75%的酒精溶液浸泡30s。 （5）弃去酒精溶液，（无菌水冲洗）然后用250ml 0.1%升汞溶液浸泡5～10min，期间不断用摇动烧杯。回收0.1%升汞溶液，用无菌水洗涤3遍叶片待用。 （6）取无菌烟草叶片，在无菌且含有滤纸的玻璃培养皿中，吸干水分去掉主叶脉和大的侧叶脉，将叶片切成1.0-1.5cm2的小方块。 （7）解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。 （8）轻轻打开封口膜，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌，同时把长镊子也放在火焰上方灼烧，将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝，用镊子取出切好的叶片小方块放到培养基①表面，下表皮与培养基接触，用镊子轻轻向下按一下，使切片部分进入培养基。接种时每三角瓶接种2~4个外植体。 （9）. 在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。然后用封口膜封口，同时写上培养材料、接种日期、姓名等。 （10） 将培养瓶放在培养温度25士2℃，光照14 h/d，光照强度2000 lx的环境中进行培养。 （11）在一个月内不定时观察烟草叶片伤愈组织不定芽生长的情况
实验二 EGFP荧光蛋白转染细胞实验
实验目的 本实验学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法-脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白）。 实验原理 外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与治理的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。 实验器材 超净工作台、细胞培养箱、镊子、酒精灯、烧杯、15ml离心管、10ul、200ul、1ml、5ml移液器、荧光倒置显微镜。 实验药品及材料 转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）、DMSO、胎牛血清、培养基、胰酶、PBS、细胞、EGFP-N1质粒。 实验步骤 第一天 细胞传代 1）使用直径为35 mm培养皿培养细胞，当细胞长至80～90%后待用； 2）去除细胞培养液后，使用1 ml PBS 冲洗 1 次，弃上清； 3）加入0.5 ml 0.25％的胰蛋白，37℃消化2 min； 4）加入0.5 ml 含10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化进程，并反复吹冲洗； 5）收集上清，将上清转移到15ml离心管内； 6) 离心，1000 转/min，5min，弃上清； 7）加入1 ml10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞； 8）在24孔板内加0.5 ml10%胎牛血清的DMEM培养基及60ul重悬细胞液； 9) 将细胞置于37˚C、5％CO2细胞培养箱培，继续培养24小时; 第二天 1）使用24孔板内培养细胞，当细胞长至50～70%后待用； 2）去除细胞培养液后，使用0.5 ml PBS 冲洗 1 次，弃上清； 3）在细胞培养皿内加入0.5 ml10%胎牛血清的DMEM培养基后待用； 4）将1.0μg EGFP-N1质粒溶于放置0.05ml 无血清培养基的A管中,轻轻混匀，室温静置5min待用； 5） 将3μl Lipofec tamine ™2000溶于放置0.05ml 无血清培养基的B管中,轻轻混匀，室温静置5min待用； 6) 将A管和 B两管混合入C管，轻轻晃动混匀后，室温放置20min； 7) 直接将0.1ml复合物加入到24孔板内中，轻轻混匀。 8）将细胞置于37˚C 、5％CO2细胞培养箱，培继续培养24小时，无须去掉复合物或更换培养基，在荧光倒置显微镜下观察细胞内GFP蛋白的表达情况。
实验三 CCK-8法检测药物（如土木香内酯）对肝癌细胞HepG2增殖的影响
实验目的： 通过本实验了解细胞的无菌操作技术、细胞传代、细胞培养以及接种的方式，掌握检测CCK-8法检测细胞增殖检测的方式，了解天然产物抗肿瘤的作用。 实验原理： Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。 实验器材 超净工作台、细胞培养箱、镊子、酒精灯、烧杯、15ml离心管、10ul、200ul、1ml、5ml移液器、酶标仪（北京六一/WD-2102A）、倒置显微镜。 实验药品及材料 MTT试剂（美国Sigma）、DMSO、胎牛血清、培养基、胰酶、PBS、CCK-8试剂（日本同仁）。 实验步骤 1）使用直径为35mm培养皿培养肝癌细胞，当细胞长至80～90%后待用； 2）去除细胞培养液后，使用1 ml PBS 冲洗1次，弃上清； 3）加入0.5 ml 0.25％的胰蛋白，37℃消化 2min； 4）加入0.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化进程，并反复吹冲洗； 5）收集上清，将上清转移到15ml离心管内； 6) 离心，1000 转/min，5min，弃上清； 7）加入1 mlDMEM培养基重悬细胞； 8）将细胞密度调整为1*105/ml，以每孔1.5*104个细胞，每孔150ul体积接种于96孔培养板中，在37˚C含5% CO2的细胞培养箱中培养24小时； 9）待细胞培养24小时后，吸出培养液，分别加入150μl含有6μM药物（的无血清DMEM培养液，每人两个复孔, 再在37˚C含5% CO2的细胞培养箱中培养24小时; 10) 在细胞刺激结束前2小时，每孔加10 ulcck-8溶解液，继续孵育2 h； 11）细胞孵育结束后，使用全自动酶标仪在490nm 处测定每孔的吸光度值（OD值）。按以下公式计算细胞活力：细胞存活率=[(实验组OD值-调零空OD值/（对照组OD 值-调零空OD值）]×100%。 免疫大实验 实验一 免疫印迹（Western Blot）实验 本实验重点难点：重点是免疫印迹的基本原理和实验的基本操作，难点是SDS-PAGE电泳凝胶的配制、电泳仪的结构和原理、转膜仪的结构和原理、转模过程的操作（防气泡的产出）。 1.1 蛋白样的制备 从体外培养的L929细胞中提取β-actin蛋白，注意提取过程中低温操作。 1.2 SDS-PAGE电泳 进行SDS-PAGE电泳，注意在电泳凝胶配制过程中凝胶要防止气泡产生，明确浓缩胶和分离胶的作用和区别，注意电泳的电压和时间。 1.3 转模 利用转膜仪将凝胶上的蛋白样转移到PVDF膜上，注意转膜过程中不能有气泡产生。 1.4 抗体孵育 将含有目的片段的PVDF膜进行封闭、一抗孵育和二抗孵育。明白封闭的作用、两种抗体的区别。 1.5 显色 利用化学发光的方法对目标蛋白进行显色，通过仪器拍照，对显色结果进行分析。了解可能影响显色结果的因素和处理方法。
实验二 细胞免疫荧光实验 本实验重点难点：重点是细胞免疫荧光实验的基本原理和操作，难点是细胞培养的操作、荧光显微镜的原理和使用。 2.1细胞准备 将对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。注意无菌操作的要求。 2.2固定 使用交联剂（如多聚甲醛）固定固定细胞（15 min）。 2.3通透 使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。 2.4封闭 使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为1 h。 2.5抗体孵育 分别用一抗和二抗对细胞进行孵育。 2.6观察 利用荧光显微镜对细胞进行观察，注意荧光显微的原理和操作。
实验三 酶联免疫吸附实验（ELISA） 本实验重点难点：重点是酶联免疫吸附实验的基本原理和操作，难点是标准样的配制和标准曲线的绘制。 3.1捕获抗体包被96孔板 将捕获抗体在包被前稀释至PBS中，将稀释至工作浓度的捕获抗体加入96孔板，每孔加入100uL，4℃孵育过夜。 3.2 封闭 用清洗液对96孔板进行清洗，每孔内加入300uL封闭缓冲液来封闭板，用封板膜封板，室温孵育1h。 3.3 加样 用清洗液对96孔板进行清洗，８. 每孔在稀释缓冲液中加入100uL样品或标准液，用封板膜封板，37℃孵育2h。 3.4 检测抗体孵育 用清洗液对96孔板进行清洗，在每孔中加入100uL用稀释缓冲液稀释的检测抗体，封板膜封板并室温孵育1h。 3.5 显色并检测 用清洗液对96孔板进行清洗， 向每个孔中添加200uL底物溶液；室温孵育20min，避免强光直射，向每孔加入50uL终止溶液，轻轻敲击孔板边缘以确保充分混合，使用设置为450nm的酶标仪立即检测每孔吸光值。 3.6 结果分析 通过标准样的结果绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测样的结果，对实验结果进行分析。 酶工程 实验一 α-淀粉酶的提取分离及纯化 本实验重点难点：疏水层析法分离纯化α-淀粉酶的基本过程，恒流泵、核酸蛋白检测仪、自动部分收集器和记录仪的使用方法。 一、实验目的 了解疏水层析的基本原理；掌握疏水层析分离纯化α-淀粉酶的基本过程；掌握恒流泵、核酸蛋白检测仪、自动部分收集器和记录仪的使用方法。 二、实验原理 疏水层析（hydrophobic interaction chromatography, HIC）也称疏水相互作用层析。水溶液中的蛋白质分子表面有Leu﹑Ile﹑Val和Phe等非极性侧链形成疏水区，因而很容易与其他高分子化合物上的疏水基团作用而被吸附，由于不同蛋白质分子的疏水区强弱有较大差异，造成与疏水吸附剂间相互作用的强弱不同，改变层析条件，使不同的蛋白质洗脱下来。 影响疏水相互作用的因素有蛋白质本身的疏水性和蛋白质的环境，疏水层析的疏水吸附剂一般在较高离子强度下吸附蛋白质，然后改变层析条件，降低盐浓度，可按低盐﹑水和有机溶剂顺序减弱疏水作用和洗脱，使不同蛋白质解吸下来，本实验用40%乙醇将α-淀粉酶洗脱下来。 实验中分离的α-淀粉酶是经枯草芽孢杆菌发酵产生，发酵液经硫酸铵沉淀后的样品可直接吸附到疏水树脂D101上，进行层析分离，得到纯度较高的α-淀粉酶，如要得到纯度更高的α-淀粉酶，可用DEAE-纤维素层析等进一步纯化。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器 层析柱1 cm*30 cm，恒流泵，核酸蛋白检测仪，自动部分收集器，记录仪，磁力搅拌器，铁架台，蝴蝶夹，螺旋止水夹，pH计或pH试纸，布氏漏斗，普通漏斗，定性滤纸，离心机，干燥箱等 2、试剂 枯草芽孢杆菌发酵液（含α-淀粉酶），固体(NH4)2SO4，D101大孔型吸附树脂，40%乙醇溶液，95%乙醇，2 mol/L HCl，2 mol/L NaOH，丙酮 四、实验步骤 1、大孔型吸附树脂D101的处理 将20 g大孔型吸附树脂D101置于150 ml烧杯中，加60 ml 95%乙醇浸泡3 h，在布氏漏斗上抽干，再用蒸馏水抽洗数次，将树脂重新放回烧杯中，加2 mol/L HCl 60 ml浸泡2 h，在布氏漏斗上用蒸馏水抽洗至中性，再放回烧杯中加2 mol/L NaOH浸泡1.5 h，在布氏漏斗上用蒸馏水抽洗至中性备用。 2、枯草芽孢杆菌发酵液的盐析 取120 ml发酵液，调pH至6.7～7.8，加固体(NH4)2SO4使其浓度达到40%～42%，加完(NH4)2SO4后静置数小时，即可抽滤或离心，收集滤饼，将滤饼溶于蒸馏水中，最终体积为100 ml，制成α-淀粉酶的粗酶液，待用。 植物中提取α-淀粉酶：称取1 g萌发3天的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 ml蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入100 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。 3、吸附﹑装柱﹑洗脱和收集 层析系统：洗脱缓冲液——恒流泵——层析柱——核酸蛋白检测仪/记录仪——自动部分收集器。 将15 g上述处理好的大孔型吸附树脂D101于250 ml烧杯内，加入100 ml α-淀粉酶的粗酶溶液，置于电磁搅拌吸附1 h，停止搅拌，静置数分钟，倾倒去部分清液。将树脂慢慢转移至一根直径为1 cm，高为30 cm的层析柱中，打开层析柱出口，让吸附后的废液流出，当液面与柱床表面相平时关闭出口，用滴管加入40%乙醇溶液，柱上端接恒流泵，以0.5 ml/min的流速用40%的乙醇洗脱，用核酸蛋白检测仪检测280 nm的光吸收（使用前用洗脱缓冲液调零），自动部分收集器收集，每管5 ml用记录仪绘制洗脱曲线，根据峰形合并洗脱液，取1 ml洗脱液按α-淀粉酶活力测定的方法测定酶活力（将酶液用蒸馏水做适当稀释，测酶活时以蒸馏水做空白对照）。将有酶活性的洗脱液加入1倍体积预冷的95%乙醇进行沉淀，在冰箱中静置1 h后离心，然后用丙酮脱水3次（或无水乙醇脱水），置于干燥箱中过夜，取出酶粉称重并按α-淀粉酶活力测定的方法测定酶活力。 4、解吸后树脂的再处理 取出柱中的树脂，用2 mol/L NaOH浸泡4 h，在布氏漏斗上抽滤，用水洗至中性，留待以后使用。 五、注意事项 （1）装柱前观察层析柱两端螺旋帽尼龙垫片、密封圈是否完好，切勿将密封圈丢弃。树脂需缓慢均匀加入，不能产生泡沫，保证无气泡、无纹格、表面平整。 （2）仪器使用完毕后，必须用蒸馏水清洗核酸蛋白检测仪样品池和管道，以免样品池受到污染。 六、思考题 1、大孔型吸附树脂D101用时为何要用95%乙醇、酸、碱来处理? 2、生物学研究中常用的层析方法有哪些？它们的原理是什么？ 七、实验结果及分析 1、恒流泵转速测定结果；自动部分收集器参数设置（每管收集体积）；核酸蛋白检测仪检测结果（记录每管检测读数）；记录仪洗脱曲线（附峰图）。 2、α-淀粉酶活力测定：标明洗脱液合并管数及总体积；酶液的稀释倍数；空白对照及α-淀粉酶活力测定结果（记录反应时间及OD值）。 3、实验中出现的问题及分析。
实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定α-淀粉酶的纯度 本实验重点难点：SDS-PAGE计算蛋白质相对分子质量的方法。 一、实验目的 了解鉴定蛋白质的方法；掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和使用方法；掌握通过SDS-PAGE计算蛋白质相对分子质量的方法；掌握SDS-PAGE鉴定α-淀粉酶的基本过程。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质电泳的主要方法。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N, N'-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在自由基的引发下，聚合成网状立体结构凝胶。利用PAGE的分子筛效应和电荷效应，将蛋白质根据分子大小、形状和电荷差异进行分离。 十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，可以按一定比例与蛋白质分子结合，让蛋白质带上大量负电荷。这些负电荷消除了不同蛋白质原有的电荷差异，同时蛋白质分子充分解聚成单体。在SDS-PAGE中，蛋白质的迁移率只取决于分子大小，而与电荷及分子形状无关。当蛋白分子量在15 kDa-200 kDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 三、仪器和试剂 1、仪器 垂直板电泳槽及其配件，稳压稳流电泳仪，脱色摇床，微量移液器，pH计或pH试纸，电磁炉，电磁炉锅等 2、试剂 （1）30% Acr/Bis贮液：29.2 g Acr + 0.8 g Bis，重蒸水定容至100 ml，过滤后置棕色瓶中，4℃保存。 （2）10% SDS溶液 （3）10%过硫酸铵（Ap）溶液：0.1 g过硫酸铵，加入1 ml重蒸水，现配现用。 （4）四甲基乙二胺（TEMED）：4℃密封保存。 （5）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 8.8，18.15 g Tris加浓盐酸调pH 8.8，定容到100 ml。 （6）浓缩胶缓冲液：1 mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 6.8，6 g Tris，加浓盐酸调pH 6.8，定容到50 ml。 （7）10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，30.28 g Tris，144.13 g甘氨酸和10 g SDS，加水定容到1000 ml，不用调pH。 （8）5×上样缓冲液：0.5 g SDS，0.25 ml β-巯基乙醇（可在使用前加入），2.5 ml甘油，25 mg溴酚蓝，1.25 ml 1 mol/L浓缩胶缓冲液，用水溶解并稀释到5 ml。 （9）预染标准蛋白Marker（Thermo）：180，130，100，70（红），55，40，35，25，15，10（绿） kDa。 （10）α-淀粉酶蛋白标准品：10 mg/ml，10 mg α-淀粉酶蛋白标准品，加入1 ml蒸馏水，现配现用。 （11）固定液：450 ml甲醇，100 ml冰醋酸，加水定容至1000 ml。 （12）考马斯亮蓝染色液：0.5 g考马斯亮蓝R250，加固定液500 ml。 （13）脱色液：100 ml甲醇，75 ml冰醋酸，加水定容至1000 ml。 四、实验步骤 1、制胶 清洗玻璃板并晾干，架好胶板，安装制胶架，可加入蒸馏水检测是否漏液。根据分离对象的分子量选择合适的凝胶孔径，配制分离胶。本实验选用10%的分离胶进行电泳分离。 配制5 ml分离胶： 凝胶浓度/% 8 10 12 15 重蒸水 2.3 1.9 1.6 1.1 ml Acr/Bis(30%) 1.3 1.7 2.0 2.5 ml 1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8 1.3 1.3 1.3 1.3 ml 10% SDS 50 50 50 50 μl TEMED 3 2 2 2 μl 10% Ap 50 50 50 50 μl 总体积 5 5 5 5 ml 混匀后加入制胶板中，距上口约3 cm处停止，并小心在胶面上加入一薄层蒸馏水，约40 min，等胶自然聚合后倾斜倒出蒸馏水，或用移液器将水吸去，并用滤纸吸干水分。 配制2 ml 5%浓缩胶： 重蒸水 1.4 ml Acr/Bis(30%) 0.33 ml 1.0 mol/L Tris-HCl pH 6.8 0.25 ml 10% SDS 20 μl TEMED 2 μl 10% Ap 20 μl 总体积 2 ml 充分混匀后立即加入制胶板中，插上11孔样品梳。待聚合后，小心拔出梳子，即可见多个样品孔，也可放入电泳槽加入缓冲液后再拔出梳子。 2、样品制备 将α-淀粉酶蛋白标准品（原液及5倍稀释）与5×上样缓冲液混合（20 μl样品+5 μl缓冲液），用移液器吹打混匀，于沸水浴中加热3～5 min，使蛋白充分变性。取出冷却至室温待用。同时将实验一纯化的α-淀粉酶样品（40%乙醇洗脱原液及5倍、10倍、20倍稀释）与5×上样缓冲液混合，处理后一起点样。 3、点样 将胶板凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，用微量移液器分别吸取10 μl不同浓度α-淀粉酶蛋白样品液，注入到样品孔内。同时加入5 μl预染标准蛋白Marker，记录上样顺序和上样量。 4、电泳 盖上盖子，注意区分正负极，将电泳槽连接电泳仪，初始电压用80 V，待样品进入分离胶时升高到120 V。注意内槽不要出现漏液。当指示剂溴酚蓝移动到离底部约0.5-1 cm时，停止电泳。 5、染色 将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下胶。移去浓缩胶，标记溴酚蓝位置，将分离胶用考马斯亮蓝染色液于脱色摇床染色1～2 h。 6、脱色 染色结束后，回收染色液。用自来水漂洗一次，加入脱色液于脱色摇床脱色至区带清晰为止，其间可更换脱色液几次。 7、结果观察、照相 观察电泳结果并拍照保存，进行蛋白纯度及电泳图谱分析。 8、计算样品相对分子质量 用直尺精确测量溴酚蓝和各种蛋白质距离加样端的迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移的距离为d2，根据下面的公式计算各种蛋白质的迁移率X。 d2 X＝ — d1 以标准蛋白的迁移率为横座标，以其对应的相对分子质量对数为纵座标，用Excel作图，可得到一条标准曲线和公式：lgMW=k-bX，式中MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。然后根据待测α-淀粉酶样品的迁移率，可计算出其对应的相对分子质量。 五、注意事项 （1）丙烯酰胺和N, N’-亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴一次性手套。两者聚合后即无毒性，但为避兔接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上一次性手套操作。配制过程凝胶要聚合充分，没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近，一定要催化充分使之完全聚合集中处理。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。加速剂TEMED有毒，易挥发，使用后应立即拧紧瓶盖。添加时要戴一次性手套、口罩操作，有条件可于通风橱中加入。 （2）过硫酸铵是凝胶不聚合的主要原因，要使用高纯度、未潮解试剂。过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的10%过硫酸铵要分装冷藏，存放期一般不超过2周。 （3）制备聚丙烯酰胺凝胶时常漏出胶液，是因为两块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，兔去了封边和拆边的麻烦，还可以同时制备多块凝胶。 （4）过硫酸铵和TEMED加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。 （5）凝胶聚合时间长短与凝胶质量的关系：凝胶的聚合应该在30～60 min内完成，聚合太快凝胶不均匀，太慢则浪费时间。聚合的快慢可以增减TEMED的加入量来改变，室温较低时TEMED的量可增加2 μl。 六、思考题 1、分析电泳异常情况的原因和解决办法，如果发现电泳后蛋白条带模糊不清，或呈弥散状，将如何改进实验条件？ 2、举例说明SDS-PAGE的应用和发展。 七、实验结果及分析 1、SDS-PAGE胶图（附图），标注孔道及点样顺序；根据胶图分析α-淀粉酶样品的纯度（有无杂带），注明α-淀粉酶样品位于哪两个标准蛋白Marker之间，预估其分子量范围；根据蛋白条带粗细及α-淀粉酶标准蛋白浓度，预估纯化的α-淀粉酶样品浓度。 2、测量10个标准蛋白Marker的迁移距离（单位），α-淀粉酶样品的迁移距离（注明孔道），以及溴酚蓝的迁移距离；计算10个标准蛋白Marker以及α-淀粉酶样品的迁移率X；计算10个标准蛋白Marker的lgMW值；用Excel绘制标准曲线并给出公式（附图），将α-淀粉酶样品的迁移率代入公式，计算其lgMW值及相对分子质量。 3、实验中出现的问题及分析。
实验三 α-淀粉酶的固定化及活性测定 本实验重点难点：交联法制备固定化酶的原理与操作技术，α-淀粉酶活力测定的原理及方法。 一、实验目的 了解α-淀粉酶的性质及用途；掌握交联法制备固定化酶的原理与操作技术；掌握α-淀粉酶活力测定的原理及方法；理解酶活力单位及酶活力的意义并掌握计算方法。 二、实验原理 酶固定化是通过将酶包埋于凝胶、微囊体内，或通过共价键、离子键或吸附连接至固相载体上，或通过交联剂使酶分子互相交联等方法使酶不溶或局限在一个有限的空间内的过程。通过酶固定化可使酶反复使用，便于酶与产物分离。制备固定化酶的方法很多，利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键形成网络结构的酶固定化方法称为交联法。本实验即采用这种方法，交联剂为戊二醛，载体为壳聚糖。 α-淀粉酶能水解淀粉分子中的α-1, 4糖苷键，将淀粉切成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，从而使淀粉对碘的呈蓝色特性反应逐渐消失，呈现红棕色。其颜色消逝的速度与酶活性有关，可以用来表示淀粉酶水解的程度，因而能够通过反应后溶液的吸光度值衡量酶的活力。 三、仪器和试剂 1、仪器 恒温水浴锅，恒温振摇仪，pH计或pH试纸，普通漏斗，定性滤纸，分光光度计，离心机等 2、试剂 （1）2.5%/5%戊二醛 （2）壳聚糖 （3）0.2 mol/L乙酸盐缓冲液（pH 5.6）： 0.2 mol/L乙酸钠溶液配制：称取16.4 g乙酸钠用水溶解，定容至1000 ml。 0.2 mol/L乙酸（冰醋酸）溶液配制：吸取1.18 ml乙酸用水定容至100 ml。 取0.2 mol/L乙酸钠溶液910 ml，0.2 mol/L乙酸溶液90 ml，混匀，用1 mol/L乙酸调至pH 5.6，记为pH 5.6 0.2 mol/L乙酸盐缓冲液。 （4）碘试液：0.317 g碘溶于4 ml 25%碘化钾溶液中，加水至200 ml。取其10 ml加25 ml 25%盐酸（用37%浓盐酸配制），水稀释至500 ml。 （5）1.0%可溶性淀粉溶液：准确称取105℃干燥4 h的可溶性淀粉2 g，加约20 ml水使成混悬液。然后缓缓倒入约100 ml沸水中溶解后煮沸30 s。放冷，加40 ml pH 5.6 0.2 mol/L乙酸盐缓冲液，水稀释至200 ml。 （6）基质液：10 ml 1.0%可溶性淀粉，加1 ml水混合，取其0.1 ml于10 ml碘试液中，立即混合后于波长620 nm处测定吸光度，取吸光度为0.9～1.0的1.0%可溶性淀粉溶液作为基质液。 （7）酶稀释液：0.176 g乙酸钙（分子量176.18）、1.641 g乙酸钠及5.84 g氯化钠溶于约800 ml水中，用1 mol/L乙酸调至pH 6.0后加水至1000 ml。 （8）α-淀粉酶 四、实验步骤 1、酶液的制备 精确称取α-淀粉酶0.125-0.25 g，先用少量pH 5.6乙酸盐缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研，然后移入量筒中用pH 5.6乙酸盐缓冲液定容至50 ml，通过中速定性滤纸过滤，溶液供固定化酶制备及固定前酶活力测定使用。 2、固定化酶的制备 称取1 g粉末壳聚糖（50 ml离心管），加入2.5-5%戊二醛10 ml，调节pH=8.5，搅拌均匀后，于25℃，恒温振摇1小时。取出后4000 rpm离心3 min，弃去戊二醛。然后加入20 ml蒸馏水洗涤，4000 rpm离心去上清，以除去多余的交联剂。 取前面制备的酶液20 ml，与上述处理的壳聚糖混合均匀，25℃恒温振摇1-4小时。取出后，4000 rpm离心分离，倾去清液，加入20 ml蒸馏水洗涤，4000 rpm离心去上清。用酶稀释液定容至20 ml，得固定化酶。 第1组：0.125 g酶定容至50 ml，1 g壳聚糖，5%戊二醛，酶与壳聚糖25℃恒温振摇1或4小时； 第2组：0.25 g酶定容至50 ml，1 g壳聚糖，5%戊二醛，酶与壳聚糖25℃恒温振摇1或4小时； 第3组：0.125 g酶定容至50 ml，1 g壳聚糖，2.5%戊二醛，酶与壳聚糖25℃恒温振摇1或4小时； 第4组：0.25 g酶定容至50 ml，1 g壳聚糖，2.5%戊二醛，酶与壳聚糖25℃恒温振摇1或4小时。 3、固定化α-淀粉酶活力测定 固定前酶活力测定：取10 ml基质液（50 ml离心管）于40℃恒温振荡器内振摇10 min后，准确加入1 ml固定前酶试样溶液，立即振摇混匀后放回40℃振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过1 min取出0.1 ml于10 ml碘试液中（15 ml离心管），立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的吸光度At。用1 ml酶稀释液代替试样溶液作为空白试验溶液，与试验溶液同样操作，测定吸光度Ab。以下式求酶活力。 固定化酶活力测定：采用相同方法测定固定化酶活力。 酶活力单位以1 g酶在1 min内基质液中蓝色的碘减少10%时为1U/g。 酶活力=（Ab-At）/Ab×100/10×1/t×1/w t：反应时间（min） w：1 ml试样溶液中酶的重量（g） 由于固定前酶浓度过大，活力测定时变色过快，没有变色过程，直接为无色，可将上述固定前酶试样用酶稀释液做25倍或50倍稀释后作为试样溶液。固定化酶可根据活力情况做适当稀释或不稀释直接测定酶活力。 举例：计时反应是从6 min开始的，在13 min时溶液由蓝色变为浅红棕色，由蓝色消失并变为红色的试样溶液的吸光度At=0.116；空白试验溶液的吸光度Ab=0.667。 酶活力=(0.667-0.116)／0.667×10×1／13×(200×50)／1=6354.52 4、固定化后酶活力回收率计算 酶活力回收率=（固定后的酶活力单位/固定前原酶活力单位）×100% 五、注意事项 （1）测定酶活力时，试剂配制要求精确，加入时按规定顺序进行，酶反应时间应准确计算。 （2）配制α-淀粉酶时，可先在40℃水浴中加热促进溶解，再用滤纸过滤。 六、思考题 1、固定化酶的方法有哪些？原理是什么？ 2、相对游离酶来说，固定化酶有哪些优缺点？ 七、实验结果及分析 1、固定前酶活力测定：酶液的稀释倍数；空白对照及α-淀粉酶活力测定结果（记录反应时间及OD值）；给出酶活计算公式及计算结果。 固定化酶活力测定（1 h和4 h）：酶液的稀释倍数；α-淀粉酶活力测定结果（记录反应时间及OD值）；给出酶活计算公式及计算结果。 固定化后酶活力回收率（1 h和4 h）计算公式及计算结果。 2、实验中出现的问题及分析。 发酵工程:鼠李糖脂的发酵实验 实验一、鼠李糖脂摇瓶发酵和优化发酵条件； 本实验重点难点：优化条件的选择 1.1实验原理： 铜绿假单胞菌是兼性厌氧菌，在氧气充足时，可以高产鼠李糖脂，在缺氧条件时，鼠李糖脂产量低。发酵生产鼠李糖脂的过程中，影响菌株鼠李糖脂产量的因素主要包括培养基成分与培养条件。适宜的发酵培养基成分及培养条件，能够最大限度的发挥菌株能力，促进菌体生长，刺激菌株代谢生成鼠李糖脂，获得高浓度的目的产物。本章通过考察影响铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂的几个因素，确立了菌株摇瓶发酵的最佳培养基成分及培养条件，提高菌株发酵鼠李糖脂的产量，为利用发酵罐进行中试分批发酵研究奠定基础。 培养基中各组分参与构成微生物的细胞物质以及目的产物，为微生物生长发育及代谢产物生成提供必需的能量，对于微生物发酵至关重要。本实验选择碳源、氮源、无机盐等几种培养基组成作为影响因素，通过让学生设计正交实验，优化鼠李糖脂发酵条件。 1.2实验目的 （1）通过本实验初步了解鼠李糖脂发酵菌种复苏与种子菌的制备、以及接种的方式，（2）初步掌握检测菌种浓度的方式。（3）学生能够设计正交实验优化鼠李糖脂发酵条件。 1.3实验材料： 电热水壶1个、100ml烧杯1个、净化工作台1台、酒精灯1支、接种环1支、有效期内新鲜血平板2个、恒温培养箱1台。500mL三角瓶1个、透气封口膜1个、封口绳1个、高压电蒸汽灭菌锅1台、恒温摇床1台、分析天平1台（精确至0.001）、三角摇瓶若干。 2×YT培养基成分：蛋白胨4.8g、酵母粉3g、氯化钠1.5g、水300mL 摇瓶发酵培养基成分：NaNO3（含量参见表1-1），KCl 0.2g，MgSO4（含量参见表1-1），Na2HPO4 5.13g，KH2PO4 0.76g，甘油2 ml，豆油（含量参见表1-1），微量元素 0.2mL，水 1L，（其中：微量元素配方为柠檬酸三钠 1g，CoCl 0.6g，MnSO4 0.4g，FeCl3 0.14g，ZnSO4 0.7g，水 1L）， 1.4实验步骤： 1、菌种复苏（36-48小时） （1）取液氮或超低温冰箱保存菌种，取出菌种管，立即放入备用开水中，待即将完全融化时，从开水中取出，在无菌条件下，血平板划线，35℃培养12h； （2）在无菌条件下，挑取溶血圈半径较大的单菌落，接于肉汤管内，37℃，150r/min摇床培养12h； （3）在无菌条件下，血平板划线，37℃培养12-24h，注意观察种子在血平板的溶血状况，判断种子的活性。 2、种子菌扩增培养（36小时） （1）2×YT培养基配制，配好后，以300mL/瓶的规格置于三角揺瓶，封好瓶口，120℃灭菌30分钟，冷却备用； （2）在无菌条件下，将活化好的菌种接种于灭菌的培养基内，接菌种10%，于37℃，200r/min摇床培养过夜（前一天17点至第二天8点）。 3、发酵（6-7天） （1）发酵培养基配制： 本实验引导学生将碳源、氮源和无机盐的含量或者种类作为培养基的主要影响因素，每个因素设置3个水平，配置培养基（w/v）（举例：正交设计表1-1），分装于各三角摇瓶，封好瓶口，120℃灭菌30分钟，冷却备用； （2）在无菌条件下，将种子菌接种于灭菌的培养基内，接菌种10%，于37℃，200r/min摇床培养过夜6-7天。 （3）结果测定：取2ml菌液，用分光光度计检测菌体浓度，并参照实验二方法测定菌株在各培养基中产鼠李糖脂的含量，填入表1-1，通过正交分析，确定三个因素三个水平对鼠李糖脂含量影响的主次顺序，并确定最优培养基配方。
实验目的： 掌握发酵液中鼠李糖脂含量检测方法。 实验材料： 1ml移液枪1支、10ul移液枪1支、1ml及10ul枪头、1.5ml离心管等各1包、离心机1台、85%稀硫酸100ml、75%酒精若干、25ml玻璃试管20支、试管架1个、蒽酮试剂1瓶、电磁炉或加热锅或其他可持续加热沸水器材（1套）、500ml及1L烧杯各4个、制冰机或冰箱1台、可见光分光光度计1台、电脑1台 实验步骤： 一、发酵液中鼠李糖脂含量检测： ①配置85%硫酸溶液300ml备用； ②清洗需要的玻璃器皿，烘干备用； ③冰水浴备用； ④沸水浴备用； ⑤将离心发酵液在试管中500倍稀释，取1ml稀释液于另一试管中放入冰水浴中备用； ⑥配置0.2%硫酸蒽酮备用：0.2 g蒽酮溶解于100 ml 85%硫酸溶液； ⑦于冰水浴内，将硫酸蒽酮溶液加入发酵液稀释液内，冰水浴1min； ⑧从冰水浴中取出稀释液，置于沸水浴中，4~5min； ⑨自然冷却至室温。分光光度计620nm光波测吸光度； 10根据标准曲线换算鼠李糖脂含量； 根据检测结果，选取鼠李糖脂含量最高的一组实验条件组合作为摇瓶发酵鼠李糖脂的最优发酵条件。
实验三、发酵液中鼠李糖脂的粗纯和精纯 实验原理 鼠李糖脂在弱酸性、中性、碱性条件下易溶于水，易溶于甲醇、氯仿和乙醚等有机溶剂，而在酸性条件下则不溶产生沉淀。因此，可以通过酸碱调节发酵液的pH值改变其溶解度，用盐酸使鼠李糖脂从发酵液中沉淀析出，离心获得沉淀后再用碱使pH恢复中性，获得鼠李糖脂的粗纯品。得到的粗品可以进一步经层析柱进行精纯，得到含量更高的鼠李糖脂精纯品。 实验目的 （1）了解鼠李糖脂的溶解特性 （2）掌握发酵液中鼠李糖脂的粗纯和精纯方法。 实验材料： 高速离心机（1000rpm）1台、烧杯若干、搅拌棒若干、pH试纸1包、盐酸、NaOH、高压灭菌器1台。AKTA Explorer 蛋白纯化仪1台、层析柱1支、填料1L、50 ml 注射器、砂芯过滤器1套、0.45μm滤膜1盒、离心机1台、超声清洗仪1台、玻璃棒及烧杯若干、Tris、HCl、NaCl、NaOH、无水乙醇、双蒸水
实验步骤： 一、粗品纯化： ①发酵液离心，取上清液备用； ②加入50%浓度的盐酸溶液，离心除去上清液； ③沉淀水洗2-3次，加入50%浓度的氢氧化钠溶液，将pH调至7； ④调整为所需浓度，灭菌后储存。 二、精品纯化 （1）样品准备 将前期粗纯鼠李糖脂用双蒸水稀释5-10倍，调整pH至8，10000 rpm，15min，离心收集上清液，将收集的上清液过滤膜抽滤，最好再将抽滤样品置于超声清洗仪中超声脱气10min待用。 （2）试剂配制 ①结合缓冲液：20 mM Tris-HCl， pH=8.0 ②洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl，含1NaCl，pH=8.0 ③装柱液：100mM NaCl,10 mM NaOH ④20%乙醇 （3）纯化 采用已装柱、连接好设备的纯化系统进行操作。包括平衡、上样、洗脱、收集、洗柱、拆柱、关机，结合电脑软件控制完成纯化。 （4）保存 将收集到的样品酸沉后，水洗多次，碱恢复，测定鼠李糖脂含量，灭菌后储存，或冷冻干燥。 实验四、鼠李糖脂的发酵和中试搅拌式发酵罐的使用与维护（讲解演示）； 实验目的 （1）熟悉鼠李糖脂工业发酵生产工艺流程； （2）并且通过实际操作，熟悉中试搅拌式发酵罐的使用与维护方法。 实验材料： 盐酸50ml、片碱100g（每批次有差异）、2L补料瓶3个（可高温灭菌）、5L补料瓶1个（可高温灭菌）、补料孔金属插管4个（耐强酸强碱）、蠕动泵补料软管5米（可高温灭菌，耐强酸强碱）。 发酵原料用量（硝酸钠150g、氯化钾5g、硫酸镁12.5g、磷酸氢二钠128.25g、磷酸二氢钾19g、微量元素5ml、甘油50ml、植物油750ml、水25L）、5 L发酵罐1套（含控制器，各检测装置） 实验步骤： 一、发酵罐灭菌、电极校准及发酵培养基配制 （1）空气过滤器的灭菌操作 A.锅炉加热完成后，打开蒸汽总阀，先排除管道冷凝水； B.关闭空气流量计阀门； C.打开空滤蒸汽阀门，空滤排压阀门，空滤连接发酵罐管道排压阀门； D.调节空滤压力表的压力，使其压力稳定在表量程的三分之一处即可； E.蒸汽压力稳定30分钟后，关闭空气流量计处蒸汽阀门，空滤排压； F.打开空气流量计阀门，保持空气流量压力维持在表压量程三分之一处维持30分钟即可； G.关闭排压阀，关闭空滤连接发酵罐管道排压阀门。 （2）发酵罐空灭 A.打开夹套蒸汽阀门，打开发酵罐底部蒸汽阀门，打开发酵罐上部蒸汽阀门； B.调整发酵罐排压阀，夹套排压阀，使压力不超过压力表量程的三分之二； C.在控制器观察发酵罐实时温度，当温度达到120℃时，维持30分钟； D.关闭夹套蒸汽阀门，关闭发酵罐底部及上部蒸汽阀门； E.排出夹套及发酵罐压力； F.发酵罐压力低于0.03mpa时，打开发酵罐进气阀，待温度降至40℃以下即可。 （3）pH电极校准 A.将电极清洗干净； B.接好电路； C.在控制器选择1#罐pH校准项； D.用提前配置好的缓冲液进行校准，先校准6.86点，将电极润洗后置于6.68的缓冲液中，待检测值稳定后点击校准键即可； E.4.0点的校准与6.86相同； F.校准完成后，将电极正确安装，将校准液及电极配件集中放置，控制器返回跟踪页面。 （4）发酵罐培养基液配制 A.按照发酵体积要求，加入适量水； B.打开发酵罐转速，200转即可； C.按照发酵配方，准确称取各营养成分，在搅拌条件下加入发酵罐； D.此时不需加植物油，待接菌时再加； E.配好后，检查一遍，确认无误后，盖紧上盖即可。 （5）发酵罐实灭 A.打开夹套蒸汽阀门，调整夹套排压阀门，使夹套压力维持在压力表量程二分之一处； B.待罐内温度达到80℃时，打开罐低蒸汽阀门，给罐内通蒸汽，同时调整罐内压力，使其不超过压力表量程三分之二； C.待温度达到120℃时，开始计时，维持30分钟； D.温度于120℃稳定后，即可校准溶氧0点； E.溶氧0点校准完成且温度于120℃维持30分钟后，关闭夹套蒸汽阀门，关闭发酵罐底部蒸汽阀门，排出夹套压力后，关闭夹套排压阀门，打开发酵罐排压阀门； F.在控制器选择自动温控，设置温度控制点32℃及水箱温度控制点37℃； G.当罐压低于0.03mpa时，打开发酵罐进气阀，向罐内通空气，同时将罐压稳定在0.05mpa以上； H. 温度降至32℃时，系统自动维持此温度，此时将通气量调至30，转速调至300转罐压稳定在0.05mpa； I.温度及罐压稳定后即可校准溶氧100点，完成后返回实时跟踪页面即可。 二、发酵操作演示 仪器材料：电蒸汽锅炉1台、空气压缩机1台、空气干燥机1台、5L发酵罐1套（含控制器，各检测装置）、配套出料软管5米 （1）发酵罐接菌操作流程 ①摇床培养菌种备用； ②关闭通气阀，将发酵罐内气压排除为零，关闭排气阀； ③灭菌环倒入95%酒精，松开进料口盖，放好灭菌环，点燃酒精，打开进料口盖，小量通气； ④接菌，摇瓶摇匀，在火焰上打开摇瓶口，摇瓶口在火焰上过2-3s，接入菌种，接菌过程中不要言语，避免呼吸对着接菌口； ⑤接完菌后，进料口盖子，在火上烧5s，移开灭菌环，盖好盖子； ⑥调大通气量，打开排气阀，开始发酵培养。 （2）开始发酵参数控制 无需补料，随着发酵时间的推进以50r/min的幅度增大转速，空气流量维持不变，pH不做控制，溶氧随着微生物的增长而降低，通过提高转速控制溶氧不低于30，接菌时接入3%单独灭菌的植物油，取样100ml离心，随着时间的推移菌量将逐渐增大。 （3）结束参数控制 结合pH和溶氧变化补料，空气流量和溶氧联动控制，随着微生物生长pH渐渐升高，转变为产代谢物的生产，pH开始降低，适时调整酸碱，取样离心发现油量快用完时立刻补油，泡沫控制。 以上各时段参数控制指标视实际情况或上下浮动。 （5）出罐操作流程 ①卸料 A.关闭发酵罐进气阀，关闭温度自动控制，停止搅拌，排出罐压； B.用蒸汽吹卸料管道半分钟，关闭蒸汽，打开卸料阀门； C.出料完成后，拔掉所有补料管，冲洗干净后，拧紧封盖 D.取下pH电极，清洗干净，浸泡在饱和氯化钾溶液中，盖好封盖。 ②发酵罐清洗 A.打开上盖及出料阀门，冲洗罐低； B.关闭出料阀门，加水满罐，300转搅拌5分钟； C.重复上步2~3次，将罐壁及上内壁清洗干净后，排出污水； D.重新加满水，浸泡发酵罐，盖好上盖。 ③其他事项 A.发酵完成后，应将各补料瓶进行清洗，油瓶若有剩余可不用清洗；消泡剂及N源瓶若无剩余应将料瓶清洗干净，消泡剂若有剩余，应将其置于净化台； B.每次发酵完成后，及时盘点，及时补充试剂耗材。 |
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